Hva er CRISPR?

CRISPR-teknologi er et enkelt, men kraftig verktøy for redigering av genom. Det gjør det mulig for forskere å enkelt endre DNA-sekvenser og endre genfunksjon. De mange potensielle bruksområdene inkluderer å korrigere genetiske defekter, behandle og forhindre spredning av sykdommer og forbedre avlinger. Løftet vekker imidlertid også etiske bekymringer.

I populær bruk er "CRISPR" (uttales "crisper") kortfattet for "CRISPR-Cas9." CRISPR-er er spesialiserte DNA-strekninger. Proteinet Cas9 (eller "CRISPR-assosiert") er et enzym som fungerer som et par molekylsaks, som er i stand til å kutte DNA-tråder.

CRISPR-teknologien ble tilpasset fra de naturlige forsvarsmekanismene til bakterier og archaea (domene til encellede mikroorganismer). Disse organismer bruker CRISPR-avledet RNA og forskjellige Cas-proteiner, inkludert Cas9, for å folieangrep av virus og andre fremmedlegemer. De gjør det først og fremst ved å hakke opp og ødelegge DNA fra en utenlandsk inntrenger. Når disse komponentene overføres til andre, mer komplekse organismer, tillater det manipulering av gener, eller "redigering."

Fram til 2017 var det ingen som visste hvordan denne prosessen så ut. I en artikkel publisert 10. november 2017, i tidsskriftet Nature Communications, viste et team av forskere ledet av Mikihiro Shibata fra Kanazawa University og Hiroshi Nishimasu fra University of Tokyo hvordan det ser ut når en CRISPR er i aksjon for aller første tid. [Et fantastisk nytt GIF viser CRISPR Tygge opp DNA]

CRISPR-Cas9: De viktigste aktørene

CRISPRs: "CRISPR "står for" klynger av regelmessig mellomrom korte palindromiske gjentagelser. "Det er en spesialisert region av DNA med to forskjellige kjennetegn: tilstedeværelsen av nukleotidrepetisjoner og avstandsstykker. Gjentatte sekvenser av nukleotider - byggesteinene til DNA - er fordelt over en CRISPR Avstander er biter av DNA som er ispedd mellom disse gjentatte sekvensene.

Når det gjelder bakterier, er avstandsstykkene hentet fra virus som tidligere angrep organismen. De fungerer som en bank av minner, som gjør det mulig for bakterier å gjenkjenne virusene og bekjempe fremtidige angrep.

Dette ble først demonstrert eksperimentelt av Rodolphe Barrangou og et team av forskere ved Danisco, et mat ingredienser selskap. I en artikkel fra 2007 publisert i tidsskriftet Science, brukte forskerne Streptococcus thermophilus bakterier, som ofte finnes i yoghurt og andre meierikulturer, som deres modell. De observerte at etter et virusangrep ble nye avstandsstykker inkorporert i CRISPR-regionen. Dessuten var DNA-sekvensen til disse avstandsstykkene identisk med deler av virusgenomet. De manipulerte også avstandsstykkene ved å ta dem ut eller sette inn nye virale DNA-sekvenser. På denne måten var de i stand til å endre bakteriens motstand mot et angrep av et spesifikt virus. Dermed bekreftet forskerne at CRISPR-er spiller en rolle i å regulere bakteriell immunitet.

CRISPR RNA (crRNA): Når en spacer er inkorporert og viruset angriper igjen, blir en del av CRISPR transkribert og behandlet til CRISPR RNA, eller "crRNA." Nukleotidsekvensen til CRISPR fungerer som en mal for å produsere en komplementær sekvens av enkeltstrenget RNA. Hver crRNA består av en nukleotidrepetisjon og en avstandsdel, ifølge en anmeldelse fra 2014 av Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier, publisert i tidsskriftet Science.

Cas9: Cas9-proteinet er et enzym som kutter fremmed DNA.

Proteinet binder seg vanligvis til to RNA-molekyler: crRNA og et annet kalt tracrRNA (eller "trans-aktiverende crRNA"). De to leder deretter Cas9 til målstedet der de vil kutte seg. Denne ekspansjonen av DNA er komplementær til en 20-nukleotidstrekning av crRNA.

Ved å bruke to separate regioner, eller "domener" på strukturen, kutter Cas9 begge strengene av DNA-dobbelt helix, og gjør det som er kjent som en "dobbeltstrenget pause", ifølge Science-artikkelen fra 2014..

Det er en innebygd sikkerhetsmekanisme, som sikrer at Cas9 ikke bare kutter noe sted i et genom. Korte DNA-sekvenser kjent som PAMs ("protospacer tilstøtende motiver") fungerer som tagger og sitter ved siden av mål-DNA-sekvensen. Hvis Cas9-komplekset ikke ser en PAM ved siden av sin DNA-sekvens, vil den ikke kutte. Dette er en mulig grunn til at Cas9 ikke noen gang angriper CRISPR-regionen i bakterier, ifølge en anmeldelse fra 2014 publisert i Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 som et redigeringsverktøy for genom

Genene til forskjellige organismer koder for en serie meldinger og instruksjoner i DNA-sekvensene deres. Genredigering innebærer å endre disse sekvensene, og dermed endre meldingene. Dette kan gjøres ved å sette inn et kutt eller bryte i DNAet og lure en celles naturlige DNA-reparasjonsmekanismer til å introdusere de endringene man ønsker. CRISPR-Cas9 gir et middel til å gjøre det.

I 2012 ble det publisert to sentrale forskningsartikler i tidsskriftene Science og PNAS, noe som bidro til å transformere bakteriell CRISPR-Cas9 til et enkelt, programmerbart genomredigeringsverktøy.

Studiene, utført av separate grupper, konkluderte med at Cas9 kunne rettes til å kutte ethvert DNA-område. Dette kan gjøres ved å bare endre nukleotidsekvensen til crRNA, som binder seg til et komplementært DNA-mål. I Science-artikkelen fra 2012 forenklet Martin Jinek og kollegene systemet ytterligere ved å fusjonere crRNA og tracrRNA for å lage en enkelt "guide RNA." Dermed krever genomredigering bare to komponenter: en guide-RNA og Cas9-proteinet.

"Driftsmessig utformer du en strekning med 20 basepar som tilsvarer et gen som du vil redigere," sa George Church, professor i genetikk ved Harvard Medical School. Et RNA-molekyl komplementært til de 20 baseparene er konstruert. Church understreket viktigheten av å sørge for at nukleotidsekvensen bare finnes i målgenet og ingen andre steder i genomet. "Da vil RNA pluss proteinet [Cas9] kutte - som et saks - DNAet på det stedet, og ideelt sett ingen andre steder," forklarte han.

Når DNAet er kuttet, sparker cellens naturlige reparasjonsmekanismer inn og jobber for å introdusere mutasjoner eller andre endringer i genomet. Det er to måter dette kan skje. I følge Huntingtons Outreach-prosjekt ved Stanford (University) innebærer en reparasjonsmetode å lime de to kuttene sammen. Denne metoden, kjent som "ikke-homolog endening," har en tendens til å introdusere feil. Nukleotider settes inn eller slettes ved et uhell, noe som resulterer i mutasjoner, som kan forstyrre et gen. I den andre metoden fikses bruddet ved å fylle ut gapet med en sekvens av nukleotider. For å gjøre det bruker cellen en kort streng DNA som mal. Forskere kan levere DNA-malen du velger, og dermed skrive inn hvilket gen de vil, eller korrigere en mutasjon.

Nytteverdi og begrensninger

CRISPR-Cas9 har blitt populært de siste årene. Church bemerker at teknologien er enkel å bruke og er omtrent fire ganger mer effektiv enn det forrige beste genomredigeringsverktøyet (kalt TALENS).

I 2013 ble de første rapportene om å bruke CRISPR-Cas9 til å redigere menneskelige celler i en eksperimentell setting publisert av forskere fra laboratoriene i Church og Feng Zhang fra Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology og Harvard. Studier som bruker in vitro (laboratorium) og dyremodeller av menneskelig sykdom, har vist at teknologien kan være effektiv til å rette opp genetiske defekter. Eksempler på slike sykdommer inkluderer cystisk fibrose, grå stær og Fanconi-anemi, ifølge en oversiktsartikkel fra 2016 publisert i tidsskriftet Nature Biotechnology. Disse studiene baner vei for terapeutiske anvendelser hos mennesker.

"Jeg tror den offentlige oppfatningen av CRISPR er veldig fokusert på ideen om å bruke genredigering klinisk for å kurere sykdom," sa Neville Sanjana fra New York Genome Center og en assisterende professor i biologi, nevrovitenskap og fysiologi ved New York University. "Dette er uten tvil en spennende mulighet, men dette er bare ett lite stykke."

CRISPR-teknologi er også blitt brukt i næringsmiddelindustrien og landbruksindustrien for å konstruere probiotiske kulturer og for å vaksinere industrikulturer (for eksempel yoghurt) mot virus. Det brukes også i avlinger for å forbedre utbytte, tørke toleranse og ernæringsmessige egenskaper.

En annen potensiell anvendelse er å lage genstasjoner. Dette er genetiske systemer, som øker sjansene for at en bestemt egenskap går over fra foreldre til avkom. Etter hvert, i løpet av generasjoner, sprer egenskapen seg gjennom hele bestander, ifølge Wyss Institute. Gendriv kan hjelpe til med å kontrollere spredning av sykdommer som malaria ved å styrke steriliteten blant sykdomsvektoren - kvinnelig Anopheles gambiae mygg - ifølge artikkelen Nature Biotechnology fra 2016. I tillegg kan genstasjoner også brukes til å utrydde invasive arter og reversere resistens mot plantevernmidler og ugressmidler, ifølge en artikkel fra 2014 av Kenneth Oye og kolleger, publisert i tidsskriftet Science.

CRISPR-Cas9 er imidlertid ikke uten ulemper.

"Jeg tror den største begrensningen av CRISPR er at den ikke er hundre prosent effektiv," fortalte Church. Dessuten kan effektiviteten til genomredigering variere. Ifølge Science-artikkelen fra 2014 av Doudna og Charpentier, skjedde genredigering i nesten 50 prosent av cellene som mottok Cas9-RNA-komplekset i en studie utført på ris. Mens andre analyser har vist at avhengig av målet, kan redigeringseffektiviteten nå opp til 80 prosent eller mer.

Det er også fenomenet "effekter utenfor målet", der DNA kuttes på andre steder enn det tiltenkte målet. Dette kan føre til introduksjon av utilsiktede mutasjoner. Videre bemerket Church at selv når systemet kutter i mål, er det en sjanse for ikke å få en nøyaktig redigering. Han kalte dette "genomvandalisme."

Sette grenser

De mange potensielle bruksområdene av CRISPR-teknologi reiser spørsmål om de etiske fordeler og konsekvenser av å tukle med genom.

I Science-artikkelen fra 2014 peker Oye og kollegene på den potensielle økologiske effekten av å bruke genstasjoner. En introdusert egenskap kunne spre seg utover målpopulasjonen til andre organismer gjennom kryssavl. Gendriv kan også redusere den genetiske mangfoldet i målpopulasjonen.

Å gjøre genetiske modifikasjoner av menneskelige embryoer og reproduksjonsceller som sæd og egg er kjent som redigering av kim. Siden endringer i disse cellene kan overføres til påfølgende generasjoner, har bruk av CRISPR-teknologi for å gjøre kimlinjeendringer reist en rekke etiske bekymringer.

Variabel effekt, effekter utenfor målet og upresise endringer utgjør alle sikkerhetsrisikoer. I tillegg er det mye som fremdeles er ukjent for det vitenskapelige samfunnet. I en artikkel fra 2015 publisert i Science, bemerker David Baltimore og en gruppe forskere, etikere og juridiske eksperter at redigering av bakterier øker muligheten for utilsiktede konsekvenser for fremtidige generasjoner "fordi det er grenser for vår kunnskap om humant genetikk, gen-miljø-interaksjoner, og sykdomsveiene (inkludert samspillet mellom en sykdom og andre tilstander eller sykdommer hos samme pasient). "

Andre etiske betenkeligheter er mer nyanserte. Bør vi gjøre endringer som fundamentalt kan påvirke fremtidige generasjoner uten å ha samtykke? Hva om bruken av redigeringslinjer skiller seg fra å være et terapeutisk verktøy til et forbedringsverktøy for forskjellige menneskelige egenskaper?

For å møte disse bekymringene, satt National Academies of Sciences, Engineering and Medicine ut en omfattende rapport med retningslinjer og anbefalinger for genomredigering..

Selv om National Academies oppfordrer til forsiktighet i å forfølge grenselinjeredigering, understreker de "forsiktighet betyr ikke forbud." De anbefaler at redigering av bakterier kun gjøres på gener som fører til alvorlige sykdommer, og bare når det ikke er andre rimelige behandlingsalternativer. Blant andre kriterier understreker de behovet for å ha data om helserisikoen og fordelene og behovet for kontinuerlig tilsyn under kliniske studier. De anbefaler også å følge opp familier i flere generasjoner.

Nyere forskning

Det har vært mange nyere forskningsprosjekter basert rundt CRISPR. "Tempoet for grunnleggende forskningsfunn har eksplodert, takket være CRISPR," sa biokjemiker og CRISPR-ekspert Sam Sternberg, gruppeleder for teknologiutvikling ved Berkeley, California-baserte Caribou Biosciences Inc., som utvikler CRISPR-baserte løsninger for medisin, jordbruk og biologisk forskning.

Her er noen av de siste funnene:

• I april 2017 ga et team av forskere ut forskningen i tidsskriftet Science om at de hadde programmert et CRISPR-molekyl for å finne stammer av virus, som Zika, i blodserum, urin og spytt..
• 2. august 2017 avslørte forskere i tidsskriftet Nature at de hadde fjernet en hjertesykdomsfeil i et embryo med hell ved å bruke CRISPR.
• 2. januar 2018 kunngjorde forskere at de kan være i stand til å stoppe sopp og andre problemer som truer sjokoladeproduksjon ved å bruke CRISPR for å gjøre plantene mer motstandsdyktige mot sykdom.
• 16. april 2018 oppgraderte forskere CRISPR for å redigere tusenvis av gener på en gang, ifølge forskning publisert av tidsskriftet BioNews.

Ytterligere rapportering fra Alina Bradford, bidragsyter.

Tilleggsressurser

• Bredt institutt: En tidslinje for sentralt arbeid med CRISPR
• Nyheter om genteknologi og bioteknologi: CRISPR-Cas9 forbedret 10000 ganger av syntetiske nukleotider
• Bredt institutt: Spørsmål og svar om CRISPR